一文與您分享熒光定量PCR試劑盒的設計原理
點擊次數：1013 更新時間：2023-05-26
熒光定量PCR(Real-time PCR)技術是一種能夠實現快速、精確、靈敏檢測的分子生物學方法。其原理是在PCR反應過程中同時監測靶基因擴增產物數量的動態變化，從而推算出樣本中對應靶基因初始含量的一種手段。
熒光定量PCR試劑盒是熒光定量PCR技術的重要組成部分，在熒光定量PCR實驗中起著至關重要的作用。熒光定量PCR試劑盒通常包括模板DNA、引物（Forward和Reverse）以及探針（Probe）、酶（如Taq DNA聚合酶）、熒光染料等多種組分，這些試劑分別發揮不同作用協同完成PCR反應。
熒光定量PCR試劑盒中的引物和探針的設計與選擇具有很高的專業性和針對性，在針對不同的目的和實驗設計情況下具有各自優劣。引物序列需要與所需擴增的靶基因區域匹配，引物都有向前和向后兩個方向，以保證對兩側位于核苷酸互補鏈上的DNA序列進行擴增。而探針則要求與引物具有一定的覆蓋長度，其序列應優化至適合搭配引物并兼顧熒光特性和檢測靈敏度。目前常用的探針是TaqMan探針、MGB探針和MolecularB beacon等。
同時，在PCR反應的早期，反應產生非特異性PCR產物，這些產品通過DNA雙鏈發生耦合阻礙擴增產物的累積，嚴重影響了PCR檢測結果的準確性。為此，熒光定量PCR試劑盒需要添加Uracil-DNA聚合酶(UDG)和dUTP將殘余外源DNA分解，降低污染以及所得PCR擴增產物的假陽性率，提高PCR實驗的穩定性和準確度。
除此之外，熒光定量PCR試劑盒增加熒光染料和探測器以實現實時監控和定量 PCR 反應，它能夠不斷進行獲取數據，在PCR過程中計算核酸擴增本原數量，并在實時顯示屏幕上展示出制品的表達大小。因此，熒光定量PCR技術廣泛應用于基因分型和基因定量以及細胞凋亡等相關研究。
